14.1.1. В пируватдегидрогеназной реакции и в цикле Кребса происходит дегидрирование (окисление) субстратов (пируват, изоцитрат, α-кетоглутарат, сукцинат, малат). В результате этих реакций образуются НАДН и ФАДН2 . Эти восстановленные формы коферментов окисляются в митохондриальной дыхательной цепи. Окисление НАДН и ФАДН2 , протекающее сопряжённо с синтезом АТФ из АДФ и Н3 РО4 называется окислительным фосфорилированием .

Схема строения митохондрии показана на рисунке 14.1. Митохондрии представляют собой внутриклеточные органеллы, имеющие две мембраны: наружную (1) и внутреннюю (2). Внутренняя митохондриальная мембрана образует многочисленные складки - кристы (3). Пространство, ограниченное внутренней митохондриальной мембраной, носит название матрикс (4), пространство, ограниченное наружной и внутренней мембранами, - межмембранное пространство (5).

Рисунок 14.1. Схема строения митохондрии.

14.1.2. Дыхательная цепь - последовательная цепь ферментов, осуществляющая перенос ионов водорода и электронов от окисляемых субстратов к молекулярному кислороду - конечному акцептору водорода. В ходе этих реакций выделение энергии происходит постепенно, небольшими порциями, и она может быть аккумулирована в форме АТФ. Локализация ферментов дыхательной цепи - внутренняя митохондриальная мембрана.

Дыхательная цепь включает четыре мультиферментных комплекса (рисунок 14.2).

Рисунок 14.2. Ферментные комплексы дыхательной цепи (обозначены участки сопряжения окисления и фосфорилирования):

I. НАДН-KoQ-редуктаза (содержит промежуточные акцепторы водорода: флавинмононуклеотид и железосерные белки). II. Сукцинат-KoQ-редуктаза (содержит промежуточные акцепторы водорода: ФАД и железосерные белки). III. KoQН2 -цитохром с-редуктаза (содержит акцепторы электронов: цитохромы b и с1 , железосерные белки). IV. Цитохром с-оксидаза (содержит акцепторы электронов: цитохромы а и а3 , ионы меди Cu2+ ).

14.1.3. В качестве промежуточных переносчиков электронов выступают убихинон (коэнзим Q) и цитохром с.

Убихинон (KoQ) - жирорастворимое витаминоподобное вещество, способен легко диффундировать в гидрофобной фазе внутренней мембраны митохондрий. Биологическая роль коэнзима Q - перенос электронов в дыхательной цепи от флавопротеинов (комплексы I и II) к цитохромам (комплекс III).

Цитохром с - сложный белок, хромопротеин, простетическая группа которого - гем - содержит железо с переменной валентностью (Fe3+ в окисленной форме и Fe2+ в восстановленной форме). Цитохром с является водорастворимым соединением и располагается на периферии внутренней митохондриальной мембраны в гидрофильной фазе. Биологическая роль цитохрома с - перенос электронов в дыхательной цепи от комплекса III к комплексу IV.

14.1.4. Промежуточные переносчики электронов в дыхательной цепи расположены в соответствии с их окислительно-восстановительными потенциалами. В этой последовательности способность отдавать электроны (окисляться) убывает, а способность присоединять электроны (восстанавливаться) возрастает. Наибольшей способности отдавать электроны обладает НАДН, наибольшей способностью присоединять электроны - молекулярный кислород.

На рисунке 14.3 представлено строение реакционноспособного участка некоторых промежуточных переносчиков протонов и электронов в окисленной и восстановленной форме и их взаимопревращение.

Рисунок 14.3. Взаимопревращения окисленных и восстановленных форм промежуточных переносчиков электронов и протонов.

14.1.5. Механизм синтеза АТФ описывает хемиосмотическая теория (автор - П. Митчелл). Согласно этой теории, компоненты дыхательной цепи, расположенные во внутренней митохондриальной мембране, в ходе переноса электронов могут «захватывать» протоны из матрикса митохондрий и передавать их в межмембранное пространство. При этом наружная поверхность внутренней мембраны приобретает положительный заряд, а внутренняя - отрицательный, т.е. создаётся градиент концентрации протонов с более кислым значением рН снаружи. Так возникает трансмембранный потенциал (ΔµН+ ). Существует три участка дыхательной цепи, на которых он образуется. Эти участки соответствуют I, III и IV комплексам цепи переноса электронов (рисунок 14.4).

Рисунок 14.4. Расположение ферментов дыхательной цепи и АТФ-синтетазы во внутренней мембране митохондрий.

Протоны, выведенные в межмембранное пространство за счёт энергии переноса электронов, снова переходят в митохондриальный матрикс. Этот процесс осуществляется ферментом Н+ -зависимой АТФ-синтетазой (Н+ -АТФ-азой). Фермент состоит из двух частей (см. рисунок 10.4): водорастворимой каталитической части (F1 ) и погружённого в мембрану протонного канала (F0 ). Переход ионов Н+ из области с более высокой в область с более низкой их концентрацией сопровождается выделением свободной энергии, за счёт которой синтезируется АТФ.

14.1.6. Энергия, аккумулированная в форме АТФ, используется в организме для обеспечения разнообразных биохимических и физиологических процессов. Запомните основные примеры использования энергии АТФ:

1) синтез сложных химических веществ из более простых (реакции анаболизма); 2) сокращение мышц (механическая работа); 3) образование трансмембранных биопотенциалов; 4) активный транспорт веществ через биологические мембраны.

Переносчики электронов в дыхательной цепи организованы в надмолекулярные комплексы (табл.3).

Таблица 3

Комплексы митохондриальной цепи переноса электронов

Примечание: цитохром с не входит в состав комплекса; цитохром с является растворимым белком и перемещается между комплексами III и IV.

Комплекс I (НАДН-дегидрогеназа) катализирует перенос электронов от НАДН к коферменту Q (КоQ).

1. Комплекс представляет собой фермент, состоящий из 42 полипептидных цепей, связан с внутренней мембраной митохондрии и пересекает ее поперечном направлении.

2. Простетическими группами являются ФМН-содержащий флавопротеин и шесть FeS-центров.

3. Комплекс I катализирует 2 сопряженных процесса: 1) экзергонический транспорт к убихинону гидрид-иона от НАДН и протона из матрикса (НАДН + Н + + Q → НАД + + QН 2) и 2) эндергонический перенос 4-х протонов из матрикса в межмембранное пространство.

4. Комплекс I катализирует перенос гидрид-иона от НАДН к ФМН, от которого 2 e¯ движутся через ряд FeS-центров к FeS-белку N-2 в матриксной части комплекса. От N-2 электроны переносятся к убихинону на мембранной части комплекса с образованием QН 2 .

5. Движение протонов в межмембранное пространство приводит к образованию электрохимического потенциала на внутренней мембране митохондрий, который накапливает энергию, высвобождаемую при переносе электронов. При этом наружная сторона мембраны, обращенная к межмембранному пространству, заряжается положительно, а внутренняя сторона, обращенная к матриксу, отрицательно.

6. Суммарное уравнение реакции, которое показывает локализацию протонов можно записать следующим образом:

НАДН + 5 Н + N + Q → НАД + + QH 2 + 4H + P , где N (negative) – отрицательно заряженная сторона мембраны (матрикс), P (positive) – положительно заряженная сторона внутренней мембраны митохондрий (межмембранное пространство)

7. Убихинол (QH 2) диффундирует во внутренней мембране митохондрий от комплекса I к комплексу III, где окисляется до Q.

Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа):

1. Сукцинатдегидрогеназа (комплекс II) является интегральным белком, связанным с внутренней мембраной митохондрий и окисляет сукцинат (янтарную кислоту из ЦТК).

2. Простетические группы: ФАД, FeS-центры с четырьмя атомами Fe. Электроны транспортируются от сукцината (промежуточный продукт ЦТК) к ФАД, затем через FeS-центры к убихинону. Выталкивания протонов в межмембранное пространство не происходит, поскольку изменение свободной энергии незначительно.

3. Другие субстраты для митохондриальных дегидрогеназ отдают электроны в дыхательную цепь на уровне убихинона, но не через комплекс II (рис. 9.4).

4. Ацил-КоА (активная форма жирной кислоты) окисляется ФАД-зависимой дегидрогеназой (ацил-КоА-дегидрогеназой ), которая передает электроны на электронтранспортный флавопротеин (ЭТФ), ЭТФ:убихинол оксидоредуктазу и в дыхательную цепь на убихинон.

5. Глицерол-3-фосфат, образующийся при распаде триацилглицеролов или восстановлении диоксиацетонфосфата при гликолизе, окисляется ферментом глицерол-3-фосфатдегидрогеназой , который локализован на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий и передает электроны в дыхательную цепь на убихинон.

6. QH 2 , образующийся в результате этих реакций, окисляется комплексом III.

Комплекс III (цитохром bc 1 комплекс, убихинон:цитохром с-оксидоредуктаза) переносит электроны от восстановленного кофермента Q (убихинола) к цитохрому с , который является водорастворимой молекулой и локализован в межмембранном пространстве, и одновременно транспортирует протоны из матрикса в межмембранное пространство. Убихинол-цитохром с -редуктаза содержит 2 типа цитохромов b и c и Fe-S белки.

Механизм переноса электронов в комплексе можно представить следующим образом:

Комплекс IV (цитохром с-оксидаза, цитохромоксидаза) катализирует перенос электронов от цитохрома с к молекулярному кислороду, как конечному акцептору. Для полного восстановление кислорода до Н 2 О необходимо 4 электрона и 4Н + .

4 цит с (восстановл.) + 4 Н + + О 2 → 4 цит с (окислен.) + 2 Н 2 О

Комплекс IV представляет собой большой фермент (13 субъединиц, м.м. 204 000 Да) внутренней мембраны митохондрий. Известно, что 3 субъединицы кодируются митохондриальной ДНК. Содержит две молекулы гема а и а 3 и два иона меди (Cu A и Cu B), которые принимают электрон и восстанавливаются (Cu 2+ ↔ Cu 1+).

Электроны передаются: цитохром с → Cu A → Fe гема а → Fe гема а 3 - Cu B . Гем а 3 вместе с атомом меди Cu B образует «бинуклеарный центр», с которым связывается кислород. Кислород остается связанным между планарной структурой гема а 3 и Cu B до полного восстановления. Это препятствует образованию токсичных свободных радикалов.

Для каждых 4-х электронов, проходящих через комплекс, фермент использует 4 «субстратных» Н + из матрикса (N сторона), превращая кислород в Н 2 О. Энергия восстановительной реакции используется для выталкивания в межмембранное пространство (Р сторона) одного Н + на каждый транспортируемый электрон.

Суммарное уравнение, катализируемое комплексом IV можно представить следующим образом:

4 цит с (восстановл.) + 8 Н + N + О 2 → 4 цит с (окислен.) + 4H + P + 2 Н 2 О

K 6-й координационной связи железа цитохрома а может присоединиться HCN, H 2 S, CO. При этом валентность железа (Fe 3+) становится постоянной и поток электронов прекращается. Это механизм действия дыхательных ядов.

Похожая информация.

Где наводят протонный потенциал . Протонный потенциал преобразуется АТФ-синтазой в энергию химических связей АТФ . Сопряжённая работа ЭТЦ и АТФ-синтазы носит название окислительного фосфорилирования .

В митохондриях эукариот цепь переноса электронов начинается с окисления НАДН и восстановления убихинона Q комплексом I. Далее комплекс II окисляет сукцинат до фумарата и восстанавливает убихинон Q . Убихинон Q окисляется и восстанавливается цитохром с комплексом III. В конце цепи комплекс IV катализирует перенос электронов с цитохрома с на кислород с образованием воды . В результате реакции, на каждые условно выделившиеся 6 протонов и 6 электронов выделяются 2 молекулы воды за счёт траты 1 молекулы О 2 и 10 молекул НАД∙Н.

Комплекс I или НАДН-дегидрогеназный комплекс окисляет НАД-Н . Этот комплекс играет центральную роль в процессах клеточного дыхания и. Почти 40 % протонного градиента , для синтеза АТФ , создаются именно этим комплексом . Комплекс I окисляет НАДН и восстанавливает одну молекулу убихинона , которая высвобождается в мембрану. На каждую окисленную молекулу НАДН комплекс переносит через мембрану четыре протона . НАДН-дегидрогеназный комплекс отбирает у него два электрона и переносит их на убихинон . Убихинон растворим в липидах . Убихинон внутри мембраны диффундирует к комплексу III. Вместе с этим, комплекс I перекачивает 2 протона и 2 электрона из матрикса в митохондрии .

Электрон-транспортная цепь комплекса I. Серые стрелочки - маловероятный или ныне не существующий путь переноса

Кластер N5 имеет очень низкий потенциал и лимитирует скорость общего потока электронов по всей цепи. Вместо обычных для железосерных центров лигандов (четырёх остатков цистеина) он скоординирован тремя остатками цистеина и одним остатком гистидина , а также окружён заряженными полярными остатками, хотя и находится в глубине фермента .

Кластер N7 присутствует только в комплексе I некоторых бактерий. Он значительно удалён от остальных кластеров и не может обмениваться с ними электронами, так что по-видимому, является реликтом . В некоторых бактериальных комплексах, родственных комплексу I, между N7 и остальными кластерами обнаружены четыре консервативных остатка цистеина, а комплексе I бактерии Aquifex aeolicus был обнаружен дополнительный Fe 4 S 4 кластер, соединяющий N7 с остальными кластерами. Из этого следует вывод, что у A. aeolicus комплекс I, кроме НАДН, может использовать иной донор электронов, который передаёт их через N7 .

НАДН-дегидрогеназный комплекс окисляет НАДН, образовавшийся в матриксе в ходе цикла трикарбоновых кислот . Электроны от НАДН используются для восстановления мембранного переносчика, убихинона Q, который переносит их к следующему комплексу электрон-транспортной цепи митохондрий, комплексу III или цитохром-bc 1 -комплексу .

НАДН-дегидрогеназный комплекс работает как протонная помпа : на каждый окисленный НАДН и восстановленный Q через мембрану в межмембранное пространство перекачиваются четыре протона :

Образовавшийся в ходе реакции электрохимический потенциал используется для синтеза АТФ . Реакция, катализируемая комплексом I, обратима, этот процесс называется аэробное сукцинат -индуцированное восстановление НАД + . В условиях большого потенциала на мембране и избытка восстановленных убихинолов комплекс может восстанавливать НАД + с использованием их электронов и пропускать протоны обратно в матрикс. Этот феномен обычно наблюдается, когда много сукцината, но мало оксалоацетата или малата . Восстановление убихинона осуществляется ферментами сукцинатдегидрогеназой , или митохондриальной. В условиях высокого протонного градиента сродство комплекса к убихинолу повышается, а редокс-потенциал убихинола снижается благодаря росту его концентрации, что и делает возможным обратный транспорт электронов по электрическому потенциалу внутренней мембраны митохондрий к НАД . Данный феномен удалось наблюдать в лабораторных условиях, но неизвестно, имеет ли он место в живой клетке.

На начальных этапах исследования комплекса I широко обсуждалась модель, основанная на предположении, что в комплексе оперирует система, похожая на. Однако позднейшие исследования не обнаружили в комплексе I каких-либо внутренне связанных хинонов и полностью опровергли эту гипотезу .

НАДН-дегидрогеназный комплекс, по-видимому, имеет уникальный механизм транспорта протонов посредством конформационных изменений самого фермента. Субъединицы ND2, ND4 и ND5 называются антипорт -подобными, поскольку они гомологичны друг другу и бактериальным Mrp Na + /H + антипортам. Эти три субъединицы образуют три основных протонных канала, которые состоят из консервативных остатков заряженных аминокислот (в основном лизина и глутамата). Четвёртый протонный канал образован частью субъединицы Nqo8 и малыми субъединицами ND6, ND4L и ND3. Канал сходен по строению с аналогичными каналами антипорт-подобных субъединиц, но содержит необычно много плотно упакованных остатков глутамата со стороны матрикса, за что и получил название E-канал (латинское E используется как стандартное обозначение глутамата). От С-конца субъединицы ND5 отходит удлинение, состоящее из двух трансмембранных спиралей, соединённых необычно протяжённой (110 Å) α-спиралью (HL), которая, проходя по стороне комплекса, обращённой в матрикс, физически соединяет все три антипорт-подобные субъединицы, и возможно, участвует в сопряжении транспорта электронов с конформационной перестройкой. Ещё один сопрягающий элемент, βH, образован серией перекрывающихся и α-спиралей, он расположен на противоположной, периплазматической стороне комплекса . До сих пор окончательно неизвестно, как именно транспорт электронов сопряжён с переносом протонов. Полагают, что мощный отрицательный заряд кластера N2 может расталкивать окружающие полипептиды, вызывая тем конформационные изменения, которые неким образом распространяются на все антипорт-подобные субъединицы, расположенные довольно далеко друг от друга. Другая гипотеза предполагает, что изменение конформации вызывает в необычно длинном сайте связывания убихинона стабилизированный убихинол Q −2 с крайне низким редокс-потенциалом и отрицательным зарядом. Неизвестными остаются и многие детали кинетики конформационных изменений и сопряжённого с ними транспорта протонов .

Наиболее изученный ингибитор комплекса I - ротенон (широко применяемый как органический пестицид). Ротенон и ротеноиды - это изофлавоноиды , которые присутствуют в корнях нескольких родов тропических растениях таких как Антония (Loganiaceae ), Derris и Lonchocarpus (Fabaceae ). Ротенон давно используется как инсектицид и рыбный яд, так как митохондрии насекомых и рыб особенно к нему чувствительны. Известно, что коренные жители Французской Гвианы и другие индейцы Южной Америки использовали ротенон-содержащие растения для рыболовства уже в XVII веке . Ротенон взаимодействует с сайтом связывания убихинона и конкурирует с основным субстратом. Было показано, что долгосрочное системное подавление комплекса I ротеноном может индуцировать селективное отмирание дофаминергических нейронов (секретирующих в качестве нейротрансмиттера дофамин) . Схожим образом действует и пиерицидин А , ещё один мощный ингибитор комплекса I, структурно схожий с убихиноном. К этой же группе относится и амитал натрия - производное барбитуровой кислоты .

Несмотря на более чем 50-летнее изучение комплекса I, так и не удалось обнаружить ингибиторы, блокирующие перенос электронов внутри комплекса. Гидрофобные ингибиторы, такие как ротенон или пиерицидин, просто прерывают перенос электрона с терминального кластера N2 на убихинон .

Ещё одно вещество, блокирующее комплекс I - это аденозиндифосфатрибоза , в реакции окисления НАДН. Он связывается с ферментом в сайте связывания нуклеотида (ФАД) .

К одним из самых сильных ингибиторов комплекса I относится семейство ацетогенинов . Показано, что эти вещества образуют химические сшивки с субъединицей ND2, что косвенно указывает на роль ND2 в связывании убихинона . Любопытно отметить, что ацетогенин роллиниастатин-2 стал первым из обнаруженных ингибиторов комплекса I, который связывается в другом месте, нежели ротенон .

Умеренным ингибиторным эффектом обладает антидиабетический препарат метформин ; по-видимому, данное свойство препарата лежит в основе механизма его действия .

Электроны от сукцината сначала переносятся на ФАД, а затем через Fe-S кластеры на Q. Электронный транспорт в комплексе не сопровождается генерацией протонного градиента . Образовавшиеся при окислении сукцината 2H + остаются на той же стороне мембраны, то есть в матриксе , и затем снова поглощаются при восстановлении хинона. Таким образом комплекс II не вносит вклада в создание протонного градиента на мембране и работает только как переносчик электронов от сукцината к убихинону .

В результате окисления сукцината его электроны переносятся на ФАД , а затем передаются по цепи из железосерных кластеров от кластера к . Там эти электроны переносятся на ожидающую в сайте связывания молекулу убихинона .

Так же есть предположение, что для того что бы не давать электрону напрямую попадать с кластера на гем действует специальный воротный механизм. Вероятный кандидат на роль ворот - гистидин -207 субъединицы B, который расположен прямо между железосерным кластером и гемом, неподалёку от связанного убихинона, вероятно, он может управлять потоком электронов между этими редокс-центрами .

Существует два класса ингибиторов комплекса II: одни блокируют карман для связывания сукцината, а другие - карман для связывания убихинола . К ингибиторам, имитирующем убихинол, относятся карбоксин и теноилтрифторацетон . К ингибиторам-аналогам сукцината принадлежит синтетическое соединение малонат а также компоненты цикла Кребса , малат и оксалоацетат . Интересно, что оксалоацетат является одним из самых сильных ингибиторов комплекса II. По какой причине обычный метаболит цикла трикарбоновых кислот ингибирует комплекс II остаётся не ясным, хотя предполагают, что таким образом он может выполнять защитную роль, сводя к минимуму обратный транспорт электронов в комплексе I , в результате которого происходит образование супероксида .

Ингибиторы, имитирующие убихинол, использовались как фунгициды в сельском хозяйстве начиная с 1960-х годов. Например, карбоксин в основном использовался для заболеваний вызванных базидиомицетами , такими как стеблевы ржавчины и заболевания вызванные Rhizoctonia . В последнее время им на смену пришли другие соединения с более широким спектром подавляемых патогенов. К таким соединениям относятся боскалид , пентиопирад и флуопирам . Некоторые сельскохозяйственно значимые грибы не восприимчивы к действию этого нового поколения ингибиторов .

Цитохро́м-bс1-ко́мплекс (комплекс цитохромов bc 1) или убихинол-цитохром с-оксидоредуктаза, или комплекс III - мультибелковый комплекс дыхательной цепи переноса электронов и важнейший биохимический генератор протонного градиента на мембране митохондрий. Этот мультибелковый трансмембранный комплекс кодируется митохондриальным (цитохром b ) и ядерным геномами .

Цитохром-bс 1 -комплекс окисляет восстановленный убихинон и восстанавливает цитохром c (Е°"=+0,25 В) согласно уравнению:

Электронный транспорт в комплексе сопряжен с переносом протонов из матрикса (in) в межмембранное пространство (out) и генерацией на мембране митохондрий протонного градиента. На каждые два электрона , проходящие по цепи переноса от убихинона до цитохрома с , два протона поглощается из матрикса, и ещё четыре высвобождаются в межмембранное пространство. Восстановленный цитохром c движется вдоль мембраны в водной фракции и переносит один электрон к следующему дыхательному комплексу - цитохромоксидазе .

События, которые при этом происходят, известны как Q-цикл, который был постулирован Питером Митчеллом в 1976 году. Принцип Q-цикла состоит в том, что перенос Н + через мембрану происходит в результате окисления и восстановления хинонов на самом комплексе. При этом хиноны соответственно отдают и забирают 2Н + из водной фазы избирательно с разных сторон мембраны.

В структуре комплекса III есть два центра, или два «кармана», в которых могут связываться хиноны. Один из них, Q out -центр, расположен между железосерным кластером 2Fe-2S и гемом b L вблизи внешней (out) стороны мембраны, обращённой в межмембранное пространство. В этом кармане связывается восстановленный убихинон (QH 2). Другой, Q in -карман, предназначен для связывания окисленного убихинона (Q) и расположен вблизи внутренней (in) стороны мембраны, контактирующей с матриксом.

Необходимым и парадоксальным условием работы Q-цикла является тот факт, что время жизни и состояние семихинонов в двух центрах связывания разное. В Q out -центре Q нестабилен и действует как сильный восстановитель, способный отдать е - на низкопотенциальный гем by. В Q in -центре образуется относительно долгоживущий Q − , потенциал которого позволяет ему действовать в качестве окислителя, принимая электроны с гема b H . Ещё один ключевой момент Q-цикла связан с расхождением двух электронов , входящих в комплекс, по двум разным путям. Изучение кристаллической структуры комплекса показало, что позиция 2Fe-2S-центра относительно других редокс-центров может смещаться. Оказалось, что белок Риске имеет подвижный домен , на котором собственно и расположен 2Fe-2S кластер. Принимая электрон и восстанавливаясь, 2Fe-2S центр меняет своё положение, отдаляясь от Q out -центра и гем b L на 17 с поворотом на 60° и тем самым приближаясь к к цитохрому c . Отдав электрон цитохрому, 2Fe-2S центр, наоборот, сближается с Q out -центром для установления более тесного контакта. Таким образом, функционирует своеобразный челнок (шаттл), гарантирующий уход второго электрона на гемы b L и b H . Пока это единственный пример, когда электронный транспорт в комплексах связан с подвижным доменом в структуре белка .

Небольшая часть электронов покидает цепь переноса до того как достигнет Комплекса IV . Постоянные утечки электронов на кислород приводят к образованию супероксида . Эта небольшая побочная реакция приводит к образованию целого спектра активных форм кислорода , которые весьма токсичны и играют значительную роль в развитии патологий и старения) . Электронные протечки в основном происходят в Q in -сайте. Этому процессу способствует антимицин A . Он блокирует гемы b в их восстановленном состоянии не давая им сбросить электроны на семихинон Q , что в свою очередь приводит к повышению его концентрации. Семихинон реагирует к кислородом , что и приводит к образованию супероксида . Образовавшийся супероксид поступает в митохондриальный матрикс и межмембранное пространство, откуда он может попасть в цитозоль. Этот факт можно объянить тем, что Комплекс III, возможно, производит супероксид в форме незаряженного HOO , которому легче проникнуть сквозь внешнюю мембрану по сравнению с заряженным Супероксидом (O 2 -) .

Некоторые из этих веществ используются как фунгициды (например, производные стробилурина , наиболее известным из которых является азоксистробин , ингибитор сайта Q внеш) и противомалярийные препараты (атовакуон) .

Цитохром с оксида́за (цитохромоксидаза) или цитохром с-кислород-оксидоредуктаза, также известная как цитохром aa 3 и комплекс IV - терминальная оксидаза аэробной дыхательной цепи переноса электронов, которая катализирует перенос электронов с цитохрома с на кислород с образованием воды . Цитохромоксидаза присутствует во внутренней мембране митохондрий всех эукариот , где её принято называть комплекс IV, а также в клеточной мембране многих аэробных бактерий .

Комплекс IV последовательно окисляет четыре молекулы цитохрома с и, принимая четыре электрона, восстанавливает O 2 до H 2 O. При восстановлении O 2 четыре H + захватываются из

Строение дыхательной цепи (ДЦ), комплексы, ингибиторы. Механизм работы. Пункты сопряжения, величина ОВП компонентов ДЦ. Коэффициент Р/О, его значение.

Поэтапное «контролируемое сгорание» достигается путём промежуточного включения дыхательных ферментов, обладающих различным редокс-потенциалом. Редокс-потенциал (окислительно-восстановительный потенциал) определяет направление переноса протонов и электронов ферментами дыхательной цепи (рис.1).

Редокс-потенциал выражается значением электродвижущей силы (в вольтах ), которая возникает в растворе между окислителем и восстановителем, присутствующих в концентрации 1,0 моль/л при 25˚ С (при рН=7,0 оба находятся в равновесии с электродом, который может обратимо принимать электроны от восстановителя). При рН=7,0 редокс-потенциал системы Н 2 /2Н + +2ē равен – 0,42 v. Знак – означает, что данная редокс-пара легко отдаёт электроны, т.е. играет роль восстановителя, знак + указывает на способность редокс-пары принимать электроны, т.е. играть роль окислителя. Например, редокс-потенциал пары НАДН∙Н + / НАД + равен – 0,32 v, что говорит о высокой её способности отдавать электроны, а окислительно-восстановительная пара ½О 2 /Н 2 О имеет наибольшую положительную величину +0,81 v, т.е. кислород обладает наивысшей способностью принимать электроны.

В процессе окисления АцКоА в ЦТК, восстановленные формы НАДН2 и ФАДН2 поступают в ДЦ, где энергия электронов и протонов трансформируется в энергию макроэргических связей АТФ.

ДЦ - совокупность дегидрогеназ, которые транспортируют электороны и протоны с субстрата на кислород.

Принципы функционирования ДЦ основаны на 1-ом и 2-ом законах термодинамики.

Движущей силой ДЦ является разность ОВП. Суммарная разность всей ДЦ составляет 1,1 В. Пункты фосфорилирования должны иметь перепад ОВП = 0,25 - 0,3 В.

1. Пара НАД-Н имеет ОВП = 0,32 В.

2. Пара Q-b - / - /- - 0 В.

3. O2 - имеет +0,82 В.

ДЦ локализуется во внутренней мембране митохондрий и имеет 2 пути введения электронов и протонов или 2 входа; ДЦ образует 4 комплекса.

1 вход: НАД-зависимый (поступают электроны и протоны со всех НАД-зависимых реакций).

2 вход: ФАД-зависимый

НАД ---->ФП

Q --->b--->c 1 --->c--->aa 3 ---->1/2O 2

Янтарная кислота ---->ФП

Дыхательная цепь – форма реализации биологического окисления .

Тканевое дыхание – это последовательность окислительно-восстанови-тельных реакций, протекающих во внутренней митохондриальной мембране с участием ферментов дыхательной цепи. Дыхательная цепь имеет чёткую структурную организацию, её компоненты формируют дыхательные комплексы , порядок расположения которых зависит от величины их редокс-потенциала (рис.5.1). Количество дыхательных цепей в отдельно взятой митохондрии из клеток разных тканей неодинаково: в печени – 5000, в сердце – около 20 000, следовательно, миокардиоциты отличаются более интенсивным дыханием, чем гепатоциты.

Цепь переноса водорода и электрона (дыхательная цепь). Комплексы переноса электронов. Окислительное фосфорилирование. Хемиосмотическая теория окисления и фосфорилирования. Механизмы сопряжения процесса транспорта электронов с образованием АТФ

Цикл Кребса, глиоксилатный и пентозофосфатный пути функционируют только в условиях достаточного количества кислорода. В то же время 0 2 непосредственно не участвует в реакциях этих циклов. Точно так же в перечисленных циклах не синтезируется АТР (за исключением АТР, образующегося в цикле Кребса в результате субстратного фосфорилирования на уровне сукцинил-СоА).

Кислород необходим для заключительного этапа дыхательного процесса, связанного с окислением восстановленных коферментов NADH и FADH 2 в дыхательной электронтранспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий. С переносом электронов по ЭТЦ сопряжен и синтез АТР.

Дыхательная ЭТЦ, локализованная во внутренней мембране митохондрий, служит для передачи электронов от восстановленных субстратов на кислород, что сопровождается трансмембранным переносом ионов Н + . Таким образом, ЭТЦ митохондрий (как и тилакоидов) выполняет функцию окислительно-восстановительнои Н -помпы. ,

Б. Чане и др. (США) в 50-х годах, используя значения окислительно-восстановительных потенциалов известных в то время переносчиков е~, спектрофотометрические данные о временной последовательности их восстановления и результаты ингибиторного анализа, расположили компоненты ЭТЦ митохондрий в следующем порядке:

Пара электронов от NADH или сукцината передается по ЭТЦ до кислорода, который, восстанавливаясь и присоединяя два протона, образует воду.

Д. Грин (1961) пришел к выводу, что все переносчики электронов в митохондриальной мембране сгруппированы в четыре комплексу, что было подтверждёно дальнейшими исследованиями.

Согласно современным данным дыхательная цепь митохондрий включает в себя четыре основных мультиэнзимных комплекса и два небольших по молекулярной массе компонента -- убихинон и цитохром с

Комплекс I осуществляет перенос электронов от NADH к убихинону Q. Его субстратом служат молекулы вдутримитохондриального NADH, восстанавливающиеся в цикле Кребса. Всостав комплекса входит флавиновая FMN-зависимая NADH: убихи- нон-оксидоредуктаза, содержащая три железосерных центра (FeS N1-3). При встраивании в искусственную фосфолипидную мембрану этот комплекс функционирует как протонная помпа.

Комплекс II катализирует окисление сукцината убихиноном. Эту функцию осуществляют флавиновая (FAD-зависимая) сукцинат: убихинон-оксидоредуктаза, в состав которой также входят три железосерных центра (Fe s1 _ 3).

Koмплекс III переносит электроны от восстановленного убихинона к цитохрому с, т. е. функционирует как убихинол: цитохром Т-оксидредуктаза. В своем составе он содержит цитохромы b 556 и b 560 , цитохром с, и железосерный белок Риске. По структуре и функции этот комплекс сходен с цитохромным комплексом b 6 -- f тилакоидов хлоропластов. В присутствии убихинона комплекс III осуществляет активный трансмембранный перенос протонов.

В терминальном комплексе IV электроны переносятся от цитохрома с к кислороду. _т. е. этот комплекс является цитохромом с: кислород-оксидоредуктазой (цитохромоксидазой). В его состав входят четыре редокс-компонента: цитохромы а и а 3 и два атома меди. Цитохром а 3 и Сив способны взаимодействовать с 0 2 , на который передаются электроны с цитохрома а -- Си А. Транспорт электронов через комплекс IV сопряжен с активным транспортом ионов Н + .

В последние годы в результате изучения пространственного расположения компонентов ЭТЦ во внутренней мембпане митохондрии показано что комплексы I, III и IV пересекают мембрану. На внутренней стороне мембраны, обращенной к матриксу, два электрона и два протона от NADH поступают на флавинмононуклеотид комплекса I.

Электроны передаются на FeS-центры. Пара электронов от FeS-центров захватывается двумя молекулами окисленного убихинона, которые принимают два иона Н + , образуя семихиноны (2QH) и диффундируя к комплексу III. На эти семихиноны поступает еще пара электронов от цитохрома Ь 560 комплекса III, что делает возможной реакцию семихинонов с еще двумя протонами из матрикса с образованием 2QH 2 . Полностью восстановленный убихинон (убихинол) отдает 2е~ цитохрому Ь 556 и 2е~ FeS R -- цитохрому с,. В результате освобождаются четыре иона Н + , выходящие в межмембранное пространство митохондрии. Окисленные молекулы убихинона вновь диффундируют к комплексу I и готовы принимать от него (или от комплекса II) новые электроны и протоны. Таким образом, цитохромы Ь служат донорами двух электронов для переноса двух дополнительных протонов через липидную фазу мембраны на каждые два электрона, поступающие из комплекса I.

Водорастворимый цитохром с на наружной стороне мембраны, получив 2е~ от FeS R -- цитохрома c iy передает их на цитохром а -- Сид комплекса IV. Цитохром а 3 -- Си в, связывая кислород, переносит на него эти электроны, в результате чего с участием двух протонов образуется вода. Как уже отмечалось, цитохромоксидазный комплекс способен также переносить ионы Н + через митохондриальную мембрану.

Таким образом, из матрикса митохондрии при транспорте каждой пары электронов от NADH к 1/2 0 2 в трех участках ЭТЦ (комплексы I, III, IV) через мембрану наружу переносятся по крайней мере шесть протонов. Как будет показано далее, именно в этих трех участках окислительные процессы в ЭТЦ сопрягаются с синтезом АТР. Передача 2е~ от сукцината на убихинон в комплексе II не сопровождается трансмембранным переносом протонов. Это приводит к тому, что при использовании сукцината в качестве дыхательного субстрата в ЭТЦ остаются лишь два участка, в которых функционирует протонная помпа.

Особенностью растительных митохондрий (ртличающей их от митохондрий животных) является способность окислять экзогенный NADH, т. е. NADH, поступающий из цитоплазмы. Это окисление осуществляется по крайней мере двумя флавиновыми NADH-дегидрогеназами, из которых одна локализована на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий, а другая -- в их наружной мембране. Первая из них передает электроны в ЭТЦ митохондрий на убихинон, а вторая -- на цитохром с. Для функционирования NADH- дегидрогенэзы на наружной стороне внутренней мембраны необходимо присутствие кальция.

Другое существенное отличие растительных митохондрий состоит в том, что во внутренней мембране помимо основного (цитохромного) пути переноса электронов имеется альтернативный путь переноса е~, устойчивый к действию цианида.

Перенос электронов от NADH к молекулярному кислороду через ЭТЦ митохондрий сопровождается потерей свободной энергии. Какова судьба этой энергии? Еще в 1931 г. В. А. Энгельгардт показал, что при аэробном дыхании накапливается АТР. Он первый высказал идею о сопряжении между фосфорилированием ADP и аэробным дыханием. В 1937--1939 гг. биохимики В. А. Белицер в СССР и Г. Калькар в США установили, что при окислении промежуточных продуктов цикла Кребса, в частности янтарной и лимонной кислот, суспензиями животных тканей исчезает неорганический фосфат и образуется АТР. В анаэробных условиях или при подавлении дыхания цианидом такого фосфорилирования не происходит. Процесс фосфорилирования ADP с образованием АТР, сопряженный с переносом электронов по ЭТЦ митохондрий, получил название окислительного фосфорилирования.

Экспериментально установлено, что передача пары электронов от NADH на 0 2 сопровождается образованием по крайней мерё трех молекул АТР, т. е. коэффициент фосфорилирования Р/О = 3. Такое же значение коэффициента фосфорилирования следует из величин перепадов свободной энергии между различными группами переносчиков. Таких перепадов, достаточных для синтеза молекулы АТР, по крайней мере три: между NADH и FeS N2 в комплексе I («50 кДж), Между убихиноном и цитохромом с 1 в комплексе III («13 кДж) и, наконец, между цитохромом а -- Си А и 0 2 (ж84 кДж). Причем если окисляется сукцинат с использованием FAD, то отсутствует первый пункт фосфорилирования и при переносе 2е~ образуются лишь две молекулы АТР.

По поводу механизма окислительного фосфорилирования существуют три теории: химическая, механохимическая (конформационная) и хемиосмотическая.

Химическая и механохимическая шпотезы сопряжения. Согласно химической гипотезе в митохондриях имеются интермёдиаторы белковой природы (X, Y, Z), образующие комплексы с соответствующими восстановленными переносчиками. В результате окисления переносчика в комплексе возникает высокоэнергетическая связь. При распаде комплекса к интермедиатору с высокоэнергетической связью присоединяется неорганический фосфат, который затем передается на ADP:

Однако несмотря на упорные поиски, не удалось выделить или как-то иначе доказать реальное существование постулированных высокоэнергетических интермедиаторов типа X ~ P. Гипотеза химического сопряжения не объясняет, почему окислительное фосфорилирование обнаруживается только в препаратах митохондрий с ненарушенными мембранами. И, наконец, с позиций этой гипотезы не находит объяснения способность митохондрий подкислять внешнюю среду и изменять свой объем в зависимости от степени их энергизации.

Способность митохондриальных мембран к конформационным изменениям и связь этих изменений со степенью энергизации митохондрий послужила основой для создания механохимических гипотез образования АТР в ходе окислительного фосфорилирования. Согласно этим гипотезам энергия, высвобождающаяся в процессе переноса электронов, непосредственно используется для перевода белков внутренней мембраны митохондрий в новое, богатое энергией конформационное состояние, приводящее к образованию АТР. Одна из гипотез подобного рода, выдвинутая американским биохимиком П. Д. Бойером (1965), может быть представлена в виде следующей схемы:

Автор предположил, что запасание энергии происходит путем конформационных изменений ферментов ЭТЦ аналогично тому, как это наблюдается в белках мышц. Актомиозиновый комплекс сокращается, гидролизуя АТР. Если сокращение белкового комплекса достигается за счет другой формы энергии (за счет окисления), то расслабление, возможно, будет сопровождаться синтезом АТР.

Таким образом, согласно механохимическим гипотезам, энергия окисления превращается сначала в механическую энергию, а затем в энергию высокоэнергетической связи АТР. Однако, подобно химической теории сопряжения, механохимические гипотезы также не могут объяснить подкисление митохондриями окружающей среды.

Хемиосмотическая теория сопряжения. В настоящее время наибольшим признанием пользуется хемиосмотическая теория английского биохимика П. Митчелла (1961). Он высказал предположение, что поток электронов через систему молекул-переносчиков сопровождается транспортом ионов Н + через внутреннюю мембрану митохондрий. В результате на мембране создается электрохимический потенциал ионов Н + , включающий химический, или осмотический, градиент (АрН) и электрический градиент (мембранный потенциал). Согласно хемиосмотической теории электрохимический трансмембранный потенциал ионов Н + и является источником энергии для синтеза АТР за счет обращения транспорта ионов Н + через протонный канал мембранной Н + -АТРазы.

Теория Митчелла исходит из того, что переносчики перешнуровывают мембрану, чередуясь таким образом, что в од сторону возможен перенос и электронов, и протонов, а в об ратную -- только электронов. В результате ионы Н + накапливаются на одной стороне мембраны.

Между двумя сторонами внутренней митохондриальной мембраны в результате направленного движения протонов против концентрационного градиента возникает электрохимический потенциа Энергия, запасенная таким образом, используется для синтеза АТР как результат разрядки мембраны при обратном (по концентрационному градиенту) транспорте протонов через АТРазу, которая работает в этом случае как АТР-синтетаза.

За прошедший период хемиосмотическая гипотеза Митчелла получила целый ряд экспериментальных подтверждений. Одним из доказательств роли протонного градиента в образовании АТР при окислительном фосфорилировании может служить разобщающее действие на этот процесс некоторых веществ. Известно, что 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) подавляет синтез АТР, но стимулирует транспорт электронов (поглощение 0 2), т. е. разобщает дыхание (окисление) и фосфорилирование. Митчелл предположил, что такое действие 2,4-ДНФ связано с тем, что он переносит протоны через мембрану (т. е. является протонофором) и поэтому разряжает ее. Это предположение полностью подтвердилось. Оказалось, что разные по своей химической природе вещества, разобщающие окисление и фосфорилирование, сходны в том, что, во-первых, они растворимы в липидной фазе мембраны, а, во-вторых, это слабые кислоты, т. е. легко приобретают и теряют протон в зависимости от рН среды. В. П. Скулачев на искусственных фосфолипидных мембранах показал, что чем легче вещество переносит протоны через мембрану, тем сильнее разобщает эти процессы. Другое экспериментальное подтверждение роли протонного градиента в фосфорилировании было получено Митчеллом, который сообщил о синтезе АТР в митохондриях в результате замены щелочной инкубационной среды на кислую (т. е. в условиях искусственно созданного трансмембранного градиента ионов Н +).

В 1973 г. Э. Рэкеру (США) удалось получить липосомы (везикулы из фосфолипидов), в которые была встроена АТРаза, выделенная из митохондрий сердца быка, и хромопротеин галофильной бактерии Halobacterium halobium -- бактериородопсин, обусловливающий создание протонного градиента за счет энергии света. Фосфолипиды для реконструкции мембран этих липосом были выделены из растений (соевые бобы). Полученные таким образом гибридные пузырьки на свету осуществляли фосфорилирование.